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Aug 16, 2023

Die Pangenomik des Knollenblätterpilzes Amanita phalloides und von Agaricales zeigt die dynamische Entwicklung von Toxingenen in einem invasiven Bereich

Das ISME Journal Band 17, Seiten 1236–1246 (2023)Diesen Artikel zitieren 1709 Zugriffe 1 Zitate 46 Altmetrische Metrikdetails Der giftige europäische Pilz Amanita phalloides (die „Todeskappe“) ist

The ISME Journal Band 17, Seiten 1236–1246 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Der giftige europäische Pilz Amanita phalloides (die „Totenwurz“) dringt in Kalifornien ein. Ob sich die giftigen sekundären Metaboliten der Knollenblätterpilze bei ihrem Eindringen weiterentwickeln, ist unbekannt. Wir haben eine bioinformatische Pipeline entwickelt, um die MSDIN-Gene zu identifizieren, die der Toxizität zugrunde liegen, und haben 88 Todeskappengenome einer invasiven kalifornischen Population und aus dem europäischen Verbreitungsgebiet untersucht und dabei eine bisher ungeahnte Vielfalt von MSDINs entdeckt, die sowohl aus Kern- als auch aus Nebenelementen bestehen. Jedes Exemplar der Knollenblätterpilz-Individuum besitzt eine einzigartige Reihe von MSDINs, und die Toxin-Gene unterscheiden sich deutlich zwischen kalifornischen und europäischen Proben. MSDIN-Gene werden durch starke natürliche Selektion aufrechterhalten, und chemische Profilierung bestätigt, dass MSDIN-Gene exprimiert werden und zu unterschiedlichen Phänotypen führen; Unsere chemische Profilierung identifizierte auch ein neues MSDIN-Peptid. Toxin-Gene sind physisch innerhalb von Genomen geclustert. Wir kontextualisieren unsere Entdeckungen, indem wir nach MSDINs in Genomen aus der gesamten Ordnung Agaricales suchen und dabei aufzeigen, dass die MSDIN-Vielfalt ihren Ursprung in unabhängigen Genfamilienerweiterungen zwischen Gattungen hat. Wir berichten auch über die Entdeckung eines MSDIN in einem Amanita außerhalb der Gruppe der „tödlichen Amanitas“. Schließlich lässt die Identifizierung eines MSDIN-Gens und seines zugehörigen Verarbeitungsgens (POPB) in Clavaria fumosa darauf schließen, dass der Ursprung von MSDINs älter ist als bisher vermutet. Die dynamische Entwicklung von MSDINs unterstreicht ihr Potenzial zur Vermittlung ökologischer Wechselwirkungen und verwickelt MSDINs in die anhaltende Invasion. Unsere Daten verändern das Verständnis der Evolutionsgeschichte giftiger Pilze und betonen auffällige Parallelen zu konvergent entwickelten tierischen Toxinen. Unsere Pipeline bietet einen Fahrplan für die Erforschung von Sekundärmetaboliten in anderen Basidiomyceten und wird die Suche nach Arzneimitteln ermöglichen.

Eine umfangreiche wissenschaftliche Literatur charakterisiert die ökologischen und evolutionären Mechanismen, die den Erfolg von Organismen ermöglichen, die in neue Umgebungen eingeführt werden [1, 2]. Die Forschung wurde genutzt, um die Eindämmung der ökologischen und wirtschaftlichen Schäden zu steuern, die aus biologischen Invasionen resultieren [3]. Die Invasionsbiologie konzentrierte sich jedoch hauptsächlich auf Pflanzen- [4] und Tierarten [5]. Gladieux et al. [6] spekulieren, dass Pilzinvasionen häufiger vorkommen als Pflanzen- oder Tierinvasionen, was darauf hindeutet, dass die Forschung zu Pilzhemmungen unauffällig ist. Inzwischen haben invasive Pilze Wälder verwüstet [7], mehrere Amphibien und Fledermäuse nahezu ausgerottet [8, 9] und Krankheiten beim Menschen verursacht [10]. Über die Merkmale, die den Erfolg invasiver nichtpathogener (mutualistischer und zersetzender) Pilze in neuen Umgebungen ermöglichen, ist jedoch relativ wenig bekannt.

Sekundäre Metaboliten (SMs) von Pilzen scheinen im Gegensatz zu primären Metaboliten ökologische Wechselwirkungen zu vermitteln [11]. SMs kommen in vielen Pilzen häufig vor und prägen die Nischen von Arten, indem sie den Wettbewerb vermitteln [12,13,14], das Wirtsspektrum beeinflussen [15, 16] und vor Umweltstressoren schützen [17,18,19]. Bis vor kurzem ging man davon aus, dass SM-Profile Arten definieren, mit relativ geringen oder keinen Variationen innerhalb einer Art, aber neue Daten deuten darauf hin, dass sich lokale Anpassungen in bevölkerungsspezifischen Mustern der intraspezifischen SM-Diversität manifestieren könnten [20]. Populationsspezifische SMs beeinflussen die geografischen Verbreitungsgebiete von Arten und beeinflussen makroevolutionäre Schlussfolgerungen [20]. Die meisten Forschungsarbeiten zu Pilz-SMs zielen auf Ascomyceten ab. Während Pilze für ihre Chemie berüchtigt sind, insbesondere für ihre Fähigkeit, Halluzinationen und Vergiftungen hervorzurufen, haben die komplexe Lebensgeschichte, Genetik und technischen Herausforderungen bei der Manipulation von Basidiomyceten die Entwicklung von Werkzeugen zur Katalogisierung der SM-Diversität von Pilzen und begrenzte Beschreibungen ihrer Evolutionsgeschichte verhindert.

Der „Totenkopf“ Amanita phalloides (Vaill. ex Fr.) Link ist ein berüchtigter, giftiger Ektomykorrhiza-Basidiomycet, der in Europa heimisch ist und anderswo, unter anderem in Nordamerika und insbesondere in Kalifornien, eingeführt wurde [21, 22]. Ektomykorrhizapilze können die Konkurrenzdynamik zwischen Pflanzenarten verändern [23], die Struktur der Bodengemeinschaft verändern [24], die Metallhomöostase erleichtern [25] und den Nährstoffkreislauf beeinflussen [26]. Die potenziellen ökologischen Folgen der Verbreitungserweiterung des Knollenblätterpilzes in Kalifornien sind weiterhin unbekannt, aber sein Vorkommen [27] und die oft tödlichen Vergiftungen, die mit seinem Pilz einhergehen [28], veranlassen viele Autoren, ihn als invasiv einzustufen [29]. Faktoren, die zur Ausbreitung und zum Erfolg nicht heimischer Ektomykorrhizapilze beitragen, wurden auf der Grundlage von Modellen der Primärsukzession identifiziert [30]. Ob jedoch konkurrierende oder defensive Wechselwirkungen mit der einheimischen Artenvielfalt auch die Ausbreitung begünstigen, bleibt ungeklärt. Interspezifische Interaktionen werden häufig durch SMs vermittelt; In Pflanzen können SMs im invasiven Verbreitungsgebiet einer Art besonders ausgeprägte Auswirkungen haben und „neue Waffen“ darstellen, wenn sie mit „naiven“ einheimischen Organismen konkurrieren [31, 32]. Ob verschiedene Populationen von A. phalloides Waffen nutzen oder nutzen, ist unbekannt.

Einige der Verbindungen, die der berüchtigten Toxizität von A. phalloides zugrunde liegen, wurden identifiziert, darunter α-Amanitin, Phalloidin und Phallacidin [33]. Diese Toxine sind Bestandteile einer kürzlich entdeckten SM-Klasse namens „MSDIN“, die auf dem konservierten Aminosäure-„Leader“-Motiv Met-Ser-Asp-Ile-Asn basiert. MSDIN-Gene kodieren kurze (35–36 Aminosäuren), ribosomal synthetisierte und posttranslational modifizierte Peptide (RiPPs) [34]. Eine MSDIN-spezifische Prolyloligopeptidase (POPB) spaltet die konservierten Leader- und „Follower“-Teile des MSDIN-Pro-Proteins, was zu einem zyklisierten „Kern“ führt, der das Endprodukt wird oder ist [35]. Während die Zyklisierung verschiedener MSDIN-Kernpeptide durch chemische Analyse nachgewiesen wurde (z. B. Zhou et al. [36]), wird die Zyklisierung häufig direkt aus Sequenzdaten abgeleitet, die auf den hochkonservierten Leader- und Follower-Motiven basieren. Sinnbildlich für die SM-Literatur konzentriert sich die Forschung zu MSDINs auf die Identifizierung neuer Sequenzen verschiedener Arten unter Verwendung eines einzelnen oder einer kleinen Anzahl von Referenzgenomen; Über die Diversität dieser Gene innerhalb der Arten ist wenig bekannt. Bisher wissen wir, dass das für α-Amanitin kodierende MSDIN-Gen diskontinuierlich über Agaricales verbreitet ist und nur in den Gattungen Galerina, Lepiota und Amanita vorkommt [33]. Mehrere Autoren schließen auf einen horizontalen Gentransfer, um die diskontinuierliche Verteilung der MSDIN-Gene zu erklären (33, 37). Es bleiben jedoch Fragen zur relativen Bedeutung sowohl der horizontalen als auch der vertikalen Übertragung in der Evolutionsgeschichte der Gene (Übersicht von Walton [33]). Die jüngste Identifizierung zusätzlicher Gene, die an der Biosynthese von α-Amanitin beteiligt sind, legt nahe, dass auch eine andere, noch nicht identifizierte Vorfahrenart an der Entstehung von MSDINs beteiligt sein könnte [38]. Während α-Amanitin das einzige MSDIN ist, das von Galerina-Arten produziert wird [39, 40], hat sich die MSDIN-Genfamilie in der Gattung Amanita erweitert, was zu Dutzenden einzigartiger MSDINs führte, die in verschiedenen Arten gefunden wurden [34, 41, 42, 43]. Es wird angenommen, dass MSDINs die Abwehr gegen Insekten, Nematoden und andere Tiere vermitteln [33]. Ein Mangel an Informationen über die intraspezifische Diversität dieser Verbindungen schließt jedoch gezielte ökologische Experimente aus, die zur Erklärung der Naturgeschichte und Diversifizierung von MSDINs in Amanita erforderlich sind.

Wir wollten das Potenzial von MSDIN-Genprodukten ermitteln, Interaktionen in einer invasiven Population in Kalifornien (CA) zu beeinflussen, indem wir eine Bioinformatik-Pipeline entwickelten, um die Identifizierung von MSDIN-Genen zu automatisieren. Dabei stellten wir insbesondere folgende Fragen: (1) Kodieren die Genome kalifornischer A. phalloides-Individuen jeweils? dieselbe Suite von MSDINS. Wenn nicht, wie ist das MSDIN-Pangenom strukturiert und gibt es Kern- und akzessorische Gene? (2) Werden Toxin-Gene durch natürliche Selektion erhalten? (3) Liegt die Erweiterung der MSDIN-Genfamilie vor der Artbildung von Amanita spp. und wie hat die Expansion die physische Verteilung von MSDINs innerhalb des Genoms beeinflusst? Wir verwendeten auch chemische Analysen, um die Produktion bekannter MSDIN-Produkte zu bestätigen und nach neuen MSDIN-Peptiden zu suchen, wobei wir betonten, dass MSDIN-Genprodukte exprimiert und übersetzt werden, was zu messbaren Phänotypen und Verbindungen mit dem Potenzial führt, ökologische Wechselwirkungen zu vermitteln.

Pilze von A. phalloides wurden intensiv aus einer einzelnen invasiven Population am Point Reyes National Seashore, Kalifornien, USA (n = 68) und aus einheimischen Populationen in ganz Europa (n = 20) für insgesamt 88 Genome beprobt (Tabelle S1). . Pilze wurden zwischen 1978 und 2015 gesammelt, wobei sich die meisten Proben auf die Jahre 2014 und 2015 konzentrierten (Tabelle S1). Wir haben auch Pilze gesammelt, die mutmaßlich als Amanita thiersii und Amanita foetens in Kansas (A. thiersii) und Argentinien (A. foetens) identifiziert wurden, und wir haben diese Genome in vergleichenden Analysen und als Kontrollen verwendet. Wir haben die gesammelten Pilze mit 1–90 nummeriert (z. B. 1mAP, 2mAP). Unsere Zahlen entsprechen den AmanitaBASE-Zahlen, die in anderen Veröffentlichungen des Pringle-Labors verwendet wurden (44) (Tabelle S1). Ein einzelner Pilz (7mAP; Tabelle S1) mit einer Anordnung von sehr schlechter Qualität wurde in ersten Scans von MSDIN-Genen verwendet, aber aus nachfolgenden Analysen entfernt (die 7mAP-Anordnung war laut BUSCOs zu 10 % vollständig, und die nächstschlechteren Anordnungen). von A. phalloides waren 72,1, 91 bzw. 92 % vollständig.

Genomische DNAs wurden extrahiert und unter Verwendung einer HiSeq2500-Plattform (Illumina) im Rapid-Modus mit 251 bp Paired-End-Reads sequenziert, wie von Wang et al. beschrieben. [45]. Ein einzelnes Isolat (72mAP) wurde auch mit einer PacBio RS II Sequel-Plattform für lange Lesevorgänge (N50 = 6310 bp) sequenziert und die Daten zur Zusammenstellung des Referenzgenoms verwendet [45]. SNPs wurden mithilfe der GATK-Pipeline [46] (Tabelle S1) gemäß den Best Practices (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035535932-Germline-) aufgerufen (Wang et al. [45]). short-variant-discovery-SNPs-Indels-). SNPs wurden dann mithilfe von Parametern, die im GATK-Workflow für Nicht-Modellorganismen definiert sind (https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/articles/360035890471), hart gefiltert, insbesondere: QD < 2,0 || FS > 60,0 || MQ < 40,0|| MQRankSum < −12,5 || ReadPosRankSum < −8,0 für SNPs; und QD < 2,0 || FS > 200,0 || ReadPosRankSum < −20,0 für Indels. Pilze, die zur gleichen Ginsterkatze gehören (Klone, die von einem einzelnen Myzel-Individuum produziert wurden), wurden wie in Wang et al. beschrieben identifiziert. [45]. Kurz gesagt: Klone wurden mithilfe von zwei verschiedenen Ansätzen identifiziert: Der erste umfasste eine euklidische Distanzmatrix, die aus gefilterten SNPs resultierte, und der zweite basierte auf Verwandtschaftsanalysen (Wang et al. [45]). Darüber hinaus wurde ein einzelnes Isolat (1mAP), das in früheren Arbeiten verarbeitet, aber aufgrund von Bedenken hinsichtlich einer Sequenz mit geringer Qualität (die in unseren Bemühungen nicht offensichtlich war) nicht verwendet wurde, auf der Grundlage der hier identifizierten phylogenetischen Beziehungen klonkorrigiert (Abb. 1). Beide Ansätze identifizierten dieselben genetischen Individuen oder Gene [45].

Phylogenetische Beziehungen zwischen 38 A. phalloides-, einem Amanita thiersii- und einem Amanita foetens-Exemplar werden in einem Maximum-Likelihood-Baum dargestellt, der unter Verwendung genomweiter SNPs erstellt wurde. Farbige Kästchen zeigen das Vorhandensein eines MSDIN-Allels an, das durch eine bestimmte „Kern“-Sequenz definiert wird. Loci, die Allele oder Gruppen von Allelen an einer bestimmten physischen Stelle im Genom darstellen, werden durch leere Spalten getrennt. Zählungen größer als eins weisen auf doppelte Loci hin, die identische Allele kodieren. Im hochwertigen Referenzgenom haben wir drei Duplikationen validiert (siehe ergänzende Methoden), konnten jedoch keine Duplikationen in anderen Genomen validieren, und es sind Montagefehler möglich. Aus diesem Grund haben wir die drei duplizierten Loci aus dem Referenzgenom (*) kollabiert, um eine Kongruenz mit anderen mutmaßlichen (aber ungelösten) Duplikationen sicherzustellen. Wenn eine Kernsequenz aus SNP-Daten abgeleitet wurde, wurde ihr Zählwert auf eins gesetzt, auch wenn sie nicht in der Genomassemblierung gefunden wurde. Die Bestimmung der „bekannten“ Werte am unteren Rand der Abbildung basiert auf früheren Berichten über MSDIN-Kernsequenzen oder die Charakterisierung chemischer Produkte. Ortsnamen (in schwarzem Text) basieren auf dem Allel, das in der Referenzgenomassemblierung vorhanden ist (siehe fettgedrucktes 72mAP). Der Name eines einzelnen Locus, der nicht im Referenzgenom (FILAPIIP) gefunden wurde, wurde alphabetisch ausgewählt. Das Feld über der Heatmap zeigt die Unterschiede in der Allelhäufigkeit zwischen kalifornischen (in Rot) und europäischen (in Orange) Individuen. Signifikante Unterschiede in den Allelfrequenzen an jedem Ort basieren auf der Analyse der molekularen Varianz. Die Loci AFPHFYVPP, FFPIVFSPP, FIFPPFFIPP und SFFFPIP wurden aufgrund der Unsicherheit bei einigen Aufrufen nicht in die Allelfrequenzanalyse einbezogen (siehe Ergebnisse). † Diese MSDIN-Sequenzen sind mit reifen Produkten mit charakterisierter Bioaktivität als Toxine verbunden. Von links nach rechts: Phallacidin (AWLVDCP), Phalloidin (AWLATCP), β-Amanitin (IWGIGCDP) und α-Amanitin (IWGIGCNP).

Adapter und Sequenzen mit geringer Qualität wurden mit BBMap v38.32 aus Rohlesevorgängen entfernt [47]. Gekürzte Lesevorgänge wurden mit SPAdes v3.5.0 zusammengestellt [48]. Versuche, die MSDIN-Gene in Genomen mit vorhandener Software zu annotieren, schlugen fehl, selbst wenn Gen-Annotatoren auf Sätze bekannter MSDINs trainiert wurden. Aus diesem Grund haben wir unsere eigene Pipeline entwickelt, um unsere interessierenden Gene zu identifizieren.

Um MSDIN-Sequenzen in Genomassemblierungen zu identifizieren, haben wir eine anpassbare Bioinformatik-Pipeline erstellt. Die daraus resultierenden Rückschlüsse auf das Vorhandensein/Fehlen von MSDIN aus den Baugruppendaten wurden anhand der Ausrichtungsdaten validiert, wie unten beschrieben. Kurz gesagt, ein Satz bekannter MSDIN-Sequenzen wurde in einer ersten tBLASTn [49]-Suche nach Genomen verwendet (Tabelle S2). Treffer mit E-Werten unter 100, ein Cutoff, der mit einer veröffentlichten Studie übereinstimmt [43], wurden in alle Leserahmen übersetzt und mithilfe von MAST, das auf mit MEME identifizierten Leader- und Follower-Motiven trainiert wurde, nach MSDIN-ähnlichen Motiven gescannt [50]. Proteine, bei denen Leader-Sequenzmotive stromaufwärts von Follower-Motiven gefunden wurden und bei denen MEME einen E-Wert unter 100 ermittelte, wurden zur weiteren Analyse aufbewahrt. Alle möglichen Introns (einschließlich nicht-kanonischer GC-AG-Introns) wurden identifiziert und die resultierenden Proteine ​​wurden basierend auf bekannten Eigenschaften von MSDIN-Genen gefiltert (wie von Walton [33]; Supplementary Methods detailliert beschrieben). Unsere Pipeline besteht aus einer Reihe eigenständiger und leicht anpassbarer Skripte, die in den Zusatzmaterialien verfügbar sind. Unsere Pipeline findet alle zuvor identifizierten MSDIN-Gene in gut untersuchten Genomen (siehe ergänzende Methoden).

Als Strategie zur Identifizierung neuartiger MSDINs haben wir jedoch bioinformatische Pipeline-Parameter ausgewählt, sodass auch „MSDIN-ähnliche“ Sequenzen in die Ausgaben einbezogen wurden. Schließlich haben wir drei MSDIN-ähnliche Sequenzen, die in den Genomen von Agrocybe cylindracea (der Name dieser Art wird aus Gründen der Übereinstimmung mit NCBI beibehalten, wird aber jetzt als Cyclocybe cylindracea bekannt) und Mycena chlorophos gefunden wurden, von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Diese Sequenzen fielen auf den Mindestgrenzwert unserer Pipeline und die phylogenetischen Beziehungen zur bekannten MSDIN-Sequenz sowie das Fehlen von POPB in den entsprechenden Genomen legen nahe, dass es sich tatsächlich nicht um MSDINs handelt (Ergänzende Ergebnisse; Abb. S1).

Um Probleme im Zusammenhang mit Assemblierungsfehlern oder Fragmentierung zu vermeiden, wurden alle Aufrufe von MSDIN-Anwesenheit/-Abwesenheit mithilfe ausrichtungsbasierter Methoden validiert. Die von unserer MSDIN-Pipeline generierten Dateien identifizieren MSDIN-Regionen in Zielgenomen und ermöglichen uns so die Teilmenge der Alignment-Daten. Wir haben die Lesevorgänge aus allen Genomen von A. phalloides mithilfe von BWA MEM mit dem Referenzgenom abgeglichen (51). Die Lesetiefe an MSDIN-Loci wurde mit BEDTools [52] bestimmt. Für Alignments ohne groß angelegte Deletionen haben wir Indels und SNPs (von Wang et al. (45)) mithilfe von SAMTools faidx (53) und vcf-consensus von VCFTools (54) erneut in die Referenzgenomsequenzen eingefügt. Anschließend wurden die aus dem erneuten Einfügen von SNPs/Indels resultierenden Sequenzen mit den Assemblierungsergebnissen verglichen. In Fällen, in denen das Vorhandensein einer MSDIN durch Alignment-Daten stark unterstützt wurde, die Sequenz jedoch nicht assembliert wurde, haben wir auf einen Assemblerfehler geschlossen und MSDINs direkt aus den Alignment-Ergebnissen abgeleitet. Wenn Diskrepanzen zwischen Ausrichtungs- und Montageergebnissen festgestellt wurden, visualisierten wir mithilfe von IGV relevante Ausrichtungen neben unbeeinflussten Ausrichtungen [55]. Diskrepanzen zwischen Assemblierungs- und Alignment-Daten wurden am häufigsten durch das Auftreten heterozygoter SNPs erklärt, die zu zwei möglichen MSDIN-Sequenzen führten, in denen SPAdes [48] nur ein Allel assemblierten. An einer kleinen Untergruppe von Loci wurden mehrere heterozygote SNPs nicht durch Varianten-Calling-Software in Phasen unterteilt (dh nicht mit dem einen oder anderen homologen Chromosom im Dikaryon assoziiert). In diesen Fällen haben wir die SNP-Phaseneinstellung manuell durch Visualisierung aller (klonkorrigierten) Alignments bestätigt, wiederum unter Verwendung von IGV [55].

Wenn im Referenzgenom kein MSDIN-Locus vorhanden war, haben wir die Lesevorgänge aller Genome auf das Genom mit dem neuen MSDIN und der Assemblierung höchster Qualität (bestimmt durch den BUSCO-Score) abgeglichen. In diesen Fällen haben wir den Ort wie oben beschrieben überprüft. Da diese Fälle jedoch selten waren, wurden SNPs nicht erneut aufgerufen, sondern Varianten wurden stattdessen manuell durch Visualisierung der Alignment-Daten in IGV abgeleitet [55]. In seltenen Fällen beobachteten wir eine Fehlausrichtung der Messwerte zwischen sehr eng verwandten Loci, typischerweise wenn ein entsprechender Locus in einem ausgerichteten Isolat in der Referenz nicht vorhanden war.

Die erneute Einfügung von SNPs in das Referenzgenom lieferte starke Hinweise darauf, dass MSDINs gleichzeitig am selben Ort vorkommen. Die Locus-Struktur wurde durch groß angelegte Ausrichtungen von Contigs weiter validiert (ausführlich unter Ergänzende Methoden). Der Locus AFPHFYVPP wurde im Long-Read-Referenzgenom nicht zusammengesetzt, war aber in seiner Zusammensetzung nur mit kurzen Lesevorgängen (72 mAP) erkennbar. Loci wurden typischerweise nach den im Referenzgenom gefundenen Allelen benannt. Der FILAPIIP-Locus wurde jedoch im Referenzgenom nicht gefunden und sein Name wurde alphabetisch gewählt.

Die physische Häufung von MSDINs wurde mithilfe eines Binomialausdrucks bewertet, um die Verteilung von MSDINs zu beurteilen. Zusätzlich führten wir einen Permutationstest durch, um die beobachteten Abstände zwischen MSDIN-Loci mit einer Zufallsverteilung zu vergleichen, wie in den ergänzenden Methoden beschrieben. Korrelationen zwischen physischen und genetischen Abständen wurden mit dem in R implementierten Pearson-Korrelationstest berechnet. Wir haben die Verteilung von MSDINs über A. phalloides-Individuen mithilfe der R-Pakete ggplot2 (56), ggtree (57) und ggtreeExtra (58) visualisiert.

Um unseren Ergebnissen einen phylogenetischen Kontext zu geben, haben wir die 249 Agaricales-Genome (die 163 Arten repräsentieren) heruntergeladen, die am 22. November 2021 vom NCBI verfügbar waren (Tabelle S3). Eine Reihe von Einzelkopie-Orthologen, die in allen Pilzen konserviert sind (OrthoDB v9), wurde mithilfe von BUSCO in allen Genomen identifiziert (59). Wir haben BUSCO-Sequenzen mit MAFFT v7.475 [60] mit der Einstellung „-auto“ abgeglichen. Die resultierenden Alignments wurden mit trimAl v1.2 mit dem Parameter „-automate1“ getrimmt und zur Konstruktion von Maximum-Likelihood-Bäumen mit IQ-TREE v1.6.2 [61] verwendet, nachdem unter Verwendung des eingeschränkten Parameters „-mset“ das am besten passende Modell getestet wurde innerhalb RAxML-kompatibler Modelle. Gegebenenfalls wurde das Bootstrapping in IQ-TREE unter Verwendung von 1.000 Replikaten der ultraschnellen Bootstrapping-Näherung durchgeführt. Eine Konsensphylogenie von BUSCO-Bäumen wurde mit ASTRAL abgeleitet [62]. Wir verwendeten ein mit UpSetR [63] erstelltes UpSet-Diagramm, um MSDIN-Kernsequenzen zwischen Arten zu vergleichen, und fügten Daten von Luo et al. hinzu. [38], um Unterschiede und Überschneidungen zu identifizieren (Tabelle S2 und S4). Wir haben phylogenetische Beziehungen zwischen den hier verwendeten A. phalloides-, A. thiersii- und A. foetens-Isolaten anhand gefilterter biallelischer SNP-Daten festgestellt, die mithilfe von VCFtools so verdünnt wurden, dass keine SNPs näher als 1 kb lagen [54]. Diese Teilmenge von SNPs wurde mit IQ-TREE wie oben beschrieben verarbeitet.

POPB-Gene kodieren für ein Enzym, das für die posttranslationale Modifikation von MSDIN-Proproteinen erforderlich ist. Um sie zu identifizieren, haben wir einen Satz POPB- und POPA-Proteinsequenzen (POPA ist ein eng verwandtes Gen, das keinen Einfluss auf die MSDIN-Reifung hat) von NCBI erhalten (Abb . S2 und Tabelle S5). Wir verwendeten tBLASTn, um Zielregionen in allen Agaricales-Genomen zu identifizieren, wobei wir die Identifizierung auf allen Treffern (einschließlich sehr kurzer Alignments) mit E-Werten unter 0,01 basierten. Wir haben die 6 kb, die beide Seiten jedes Treffers flankieren, mit SAMtools faidx [53] extrahiert (insgesamt 12 kb; weniger, wenn wir auf das Ende eines zugehörigen Contigs stoßen). Wir identifizierten Kandidatengene in Zielregionen unter Verwendung von AUGUSTUS v3.4.0 [64] mit vorgefertigten Laccaria bicolor-Genmodellen und unter Verwendung von Proteinhinweisen aus bekannten POPA- und POPB-Sequenzen (Tabelle S5). Alle in den Zielregionen gefundenen Proteine ​​wurden erneut mit bekannten POPA- und POPB-Sequenzen mithilfe von BLASTp abgefragt. Die 10 häufigsten POPA- und POPB-Treffer (sortiert nach Bit-Score und je nach Verfügbarkeit maximal 20 Sequenzen) aus jedem Genom wurden analysiert: Diese Proteinsequenzen wurden mithilfe von MAFFT mit bekannten POPA- und POPB-Sequenzen abgeglichen, mithilfe von TrimAl getrimmt und anhand phylogenetischer Beziehungen ermittelt unter ihnen wurden mithilfe des IQ-Baums ermittelt, wie oben beschrieben. Die resultierenden Phylogenien wurden manuell überprüft und auf das Vorhandensein von POPB geschlossen, wenn eine Kandidatensequenz mit anderen bekannten POPB-Sequenzen eine monophyletische Gruppe bildete.

Basierend auf vorläufigen bioinformatischen Daten wurden drei europäische (5mAP, 9mAP und 29mAP) und drei kalifornische (21mAP, 23mAP und 75mAP) A. phalloides-Exemplare ausgewählt, um so viel MSDIN-Vielfalt wie möglich darzustellen. Eine kleine Probe jedes getrockneten Pilzes wurde zu einem feinen Pulver zerkleinert. Jede Probe wurde mit 10 ml 100 % Methanol extrahiert und durch Filterpapier geleitet. Die Extrakte wurden an der Luft zur Trockne reduziert, gewogen und in 100 % Methanol bei einer Endkonzentration von 1 mg/ml resuspendiert.

UHPLC-HRMS wurde auf einem Thermo Scientific Vanquish UHPLC-System durchgeführt, das mit einem Thermo Scientific Q Exactive Hybrid Quadrupol-Orbitrap-Massenspektrometer verbunden war, das im positiven Ionisationsmodus betrieben wurde. Eine Waters Acquity UPLC BEH-C18-Säule (2,1 × 100 mm, 1,7 μm) wurde mit Acetonitril (0,1 % Ameisensäure) und Wasser (0,1 % Ameisensäure) bei einer Flussrate von 0,2 ml/min verwendet. Eine Screening-Gradientenmethode wurde wie folgt implementiert: Beginnend bei 10 % organisch für 5 Minuten, gefolgt von einem linearen Anstieg auf 90 % organisch über 20 Minuten, ein weiterer linearer Anstieg auf 98 % organisch für 2 Minuten und Halten bei 98 % organisch für 5 Minuten , 3 Min. lang wieder auf 10 % Bio reduzieren und die letzten 2 Min. bei 10 % Bio halten, insgesamt 37 Min. Für die Analyse wurden zehn Mikroliter jeder Probe in das System injiziert. Drei bekannte MSDIN-Toxine, α-Amanitin, Phalloidin und Phallacidin, wurden durch den Vergleich von Profilen mit Standards identifiziert, die von Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA) erworben wurden. Die absolute Quantifizierung dieser drei Verbindungen wurde relativ zu einer Standardkurve (0,1–10 ppm) berechnet.

Populationsgenetische Analysen verwendeten einen klonkorrigierten Datensatz, um demografische Muster zu identifizieren. Wir haben Tajimas D- und Diversitätsstatistik in 500-bp-Fenstern aus Alignment-Daten mit dem PopGenome R-Paket berechnet [65]. Die Differenzierung des MSDIN-Gengehalts zwischen Europa und Kalifornien wurde mit Analysis of MOlecular VAriance (AMOVA) in GENALEX berechnet (66). Die genetische Isolierung zwischen europäischen und kalifornischen Proben wurde mithilfe der Diskriminanzanalyse der Hauptkomponenten (DAPC), die im poppr R-Paket ausgeführt wurde, weiter validiert [67].

Um die dN/dS-Verhältnisse zu messen, haben wir MSDIN-Nukleotidsequenzen mithilfe von MAFFT abgeglichen und Phylogenien mit IQ-TREE unter Verwendung der oben beschriebenen Parameter konstruiert. Sequenzausrichtungen wurden mit Pal2Nal neu formatiert [68]. Anschließend haben wir mithilfe von PAML ein einzelnes dN/dS-Verhältnis über gesamte Phylogenien geschätzt [69].

Unsere bioinformatische MSDIN-Suchpipeline und die anschließende manuelle Validierung identifizierten 2940 MSDIN-Sequenzen aus 88 A. phalloides-Genomen (Tabelle S1), die 43 einzigartige MSDIN-Aminosäuresequenzen darstellen (wie durch die Kernregion des MSDIN definiert, die zum reifen Peptid wird) (Tabelle S2). ). Dreizehn der einzigartigen MSDIN-Sequenzen sind neu (Abb. 1; Tabelle S2). Zwei dieser neuen Sequenzen (FLPPFLP und IWGKGCDP) wurden nur bei einem Individuum gefunden und sind nicht eindeutig mit einem bestimmten Locus assoziiert; Wir haben beide von weiteren Analysen ausgeschlossen. Mithilfe der Klonkorrektur haben wir identische oder nahezu identische Genome in einem einzigen Datenpunkt zusammengefasst (45). Im klonkorrigierten Datensatz identifizierten wir insgesamt 1308 MSDIN-Sequenzen in 38 A. phalloides-Individuen (Abb. 1). Die Anzahl der eindeutigen MSDIN-Sequenzen, die bei diesen 16 europäischen und 22 kalifornischen Individuen gefunden wurden, lag zwischen 25 und 32 mit einem Median von 29. Das MSDIN-Pangenom von A. phalloides umfasst 15 Kerngenome (in allen Isolaten gefunden) und 26 akzessorische Genome (gefunden). nur in einigen Isolaten) MSDINs. Zwei der MSDINs des akzessorischen Genoms wurden bei allen außer einem Individuum gefunden (Abb. 1). Die zusammengesetzten Genome waren im Durchschnitt zu 94,1 % vollständig, waren jedoch in durchschnittlich 42.500 Contigs fragmentiert (Tabelle S1). Die Anzahl der gefundenen MSDINs korrelierte nicht positiv mit der Vollständigkeit der Genomen (Abb. S3).

Die 41 einzigartigen MSDIN-Sequenzen wurden auf 31 verschiedene Loci abgebildet. Jeder Locus kodiert ein bis drei Allele (Abb. 1). Dreißig dieser Loci wurden im Referenzgenom gefunden (Tabelle S6). Wir haben Loci basierend auf dem Allel benannt, das in der Referenzgenomassemblierung vorhanden ist (siehe schwarzer Text unten in Abb. 1; ergänzende Methoden). Drei MSDINs, IWGIGCDP (β-Amanitin), AWLATCP (Phalloidin) und LIQRPFAP (nicht charakterisiert), wurden jeweils an zwei unterschiedlichen (duplizierten) Loci im Referenzgenom gefunden. Allerdings fassen die von uns verwendeten Genom-Assembler typischerweise identische Allele in einer einzigen Sequenz zusammen. Tatsächlich waren selbst eng verwandte (aber unterschiedliche, dh heterozygote) Allele manchmal nur aus SNP-Daten ersichtlich. Umgekehrt ist es möglich, dass Sequenzvariationen in der Nähe von MSDINs in dikaryotischen Kernen dazu führen würden, dass zwei identische Sequenzen aus demselben Locus in Anordnungen als zwei unterschiedliche Allele erscheinen. Während wir Duplikationen von IWGIGCDP, AWLATCP und LIQRPFAP im hochwertigen Referenzgenom validieren konnten (siehe ergänzende Methoden), war es nicht möglich, Duplikationen anderer MSDINs in anderen Genomen zu validieren. Aus diesen Gründen wählten wir einen konservativen Ansatz und kollabierten diese drei duplizierten Loci, wobei wir betonten, dass das Vorhandensein von mehr als einer Kopie eines Allels in einer Anordnung (d. h. die „Anzahl“ einer bestimmten Sequenz) auf eine ungelöste Duplikation hindeutet ( Abb. 1).

Darüber hinaus liegen die Loci FFPIVFSPP und FIFPPFFIPP physisch sehr nahe beieinander und scheinen häufig dieselben Allele zu kodieren, was Bedenken hinsichtlich einer unspezifischen Datenkartierung aufkommen lässt. Bei der Ausrichtung auf das Referenzgenom wurde gelegentlich eine unspezifische Ausrichtung der Lesevorgänge von AFPHFYVPP beobachtet, da dieser Locus im Referenzgenom fehlt (siehe ergänzende Methoden). In ähnlicher Weise gab eine Duplizierung des SFFFPIP-Locus, die in der Referenz nicht vorhanden war, Anlass zu Bedenken hinsichtlich unserer Fähigkeit, SFFFPIP-Sequenzen aufzulösen (siehe Isolate mit einer Anzahl von drei Allelen, Abb. 1). Um Interpretationsfehler im Zusammenhang mit diesen vermeintlich ungelösten Duplikationen zu vermeiden, haben wir FFPIVFSPP, FIFPPFFIPP, AFPHFYVPP oder SFFFPIP nicht in weitere Analysen einbezogen. Während unsere Ergebnisse beginnen, die Locus-Struktur von MSDINs zu entwirren, werden neue Long-Read-Technologien erforderlich sein, um diese eng verwandten Sequenzen vollständig aufzulösen.

Die kalifornischen und europäischen Sammlungen unterscheiden sich genetisch, was darauf hindeutet, dass kein einziger hier beprobter europäischer Standort die Quelle der invasiven Knollenblätterpilze ist, die wir in Kalifornien beprobt haben (Abb. S4). Um zu klären, ob Unterschiede in der Häufigkeit akzessorischer Genom-Allele zwischen nativen und invasiven Proben unterschiedliche Evolutionsgeschichten widerspiegeln, haben wir AMOVA verwendet, um eine signifikante Aufteilung der genetischen Varianz an MSDIN-Loci zu testen. Die Häufigkeit von MSDIN-Allelen war über alle Loci hinweg signifikant unterschiedlich (p = 0,001, ΦPT = 0,31). Einzelvergleiche identifizierten vier signifikant differenzierte Loci (p < 0,005 nach Mehrfachvergleichskorrektur), von denen jeder einen ΦPT > 0,24 aufweist (Abb. 1). Die Kernsequenzen IFLVFPIPP, LPILPIPPLP, GVILIIP, GFFPPFFFPP und FFLIVFFPP kommen nur in europäischen Exemplaren vor. In Übereinstimmung mit möglichen Gründereffekten in der invasiven kalifornischen Bevölkerung gibt es keine MSDIN-Sequenzen, die nur für Kalifornien gelten. Einige Allele kommen jedoch in Kalifornien häufiger vor, zum Beispiel ist das IVGILGLP-Allel des IIGILLPP-Locus das dominierende Allel in Kalifornien, kommt aber bei den europäischen Exemplaren relativ selten vor (siehe Balkendiagramm oben in Abb. 1). Es ist unwahrscheinlich, dass es sich in Europa um eine einzige panmiktische Population handelt [21], und es sind weitere Sammlungen erforderlich, um zu klären, wie sich die MSDIN-Allelfrequenzen im invasiven Bereich im Vergleich zu den derzeit unbekannten Quellpopulationen in Europa verändert haben.

MSDIN-Peptide sind wegen der extremen Toxizität einiger gängiger Peptide und/oder ihrer Derivate berüchtigt. Zu den tödlichen Toxinen gehören α-Amanitin (IWGIGCNP), β-Amanitin (IWGIGCDP), Phalloidin (AWLATCP) und Phallacidin (AWLVDCP) [33]. Die für diese Peptide kodierenden Gene sind hochkonservierte Bestandteile des Pangenoms (Abb. 1). LC-MS/MS-Profile von sechs Extrakten zeigen deutlich, dass jeder der entsprechenden Pilze α-Amanitin, Phalloidin und Phallacidin synthetisiert hatte, obwohl die relativen Mengen zwischen den Proben unterschiedlich waren (Abb. S5). Ob sich genetische Unterschiede zwischen Pilzen auf die Variation in der Toxinproduktion auswirken, ist unbekannt, aber ökologische und entwicklungsbedingte Variablen tragen zu den in Sporokarps gefundenen Toxinmengen bei (Übersicht von Walton et al. [33]). Ein chemisch unbeschriebenes MSDIN-Produkt, Cycloamanid G (GFFPPFFFPP), wurde auch in den in Italien beprobten Extrakten des 5mAP-Pilzes identifiziert (Abb. S6). Diese Sequenz stimmte genau mit einem neu identifizierten akzessorischen Gen überein (Abb. 1). Der Einfachheit halber und im Einklang mit früheren Arbeiten [33] bezeichnen wir alle MSDIN-Verbindungen mit gemeinsamer Biogenese als „Cycloamanide“, auch wenn posttranslationale Modifikationen reife MSDIN-Produkte manchmal in andere chemische Klassifizierungen einordnen.

Vergleiche von MSDINs verschiedener Gattungen und innerhalb von A. phalloides zeigen, dass Toxin-Gene ausgewählt werden. Eine starke reinigende Selektion, die auf die Kernsequenz von α-Amanitin einwirkt, zeigt sich in Vergleichen zwischen den Gattungen (Abb. 2). Innerhalb von A. phalloides deuten hochkonservierte Leader- und Follower-Regionen ebenfalls auf eine reinigende Selektion hin, während hochvariable Kernregionen möglicherweise eine diversifizierende Selektion widerspiegeln (Abb. 2). Wir können die neutrale Entwicklung als Treiber der Diversifizierung in der MSDIN-Kernregion nicht ausschließen, da die informativen Websites in allen Ausrichtungen gesättigt waren. Wir haben nicht getestet, ob sich die Selektion auf einzelne MSDIN-Kernsequenzen innerhalb von A. phalloides auswirkt, da die dN/dS-Verhältnisse innerhalb der Arten nicht zuverlässig monoton sind (überprüft von [70]). Die Auswahl kann auch aus bevölkerungsbezogenen Metriken des Standortfrequenzspektrums abgeleitet werden. Unsere Stichprobenstrategie konzentrierte sich jedoch auf die Kontextualisierung der Vielfalt einer einzelnen kalifornischen Bevölkerung innerhalb der Breite der europäischen Vielfalt. Aufgrund der Unterschiede bei der Probenahme zwischen Kalifornien und Europa zögern wir, Schätzungen von Tajimas D zu interpretieren, die mit bestimmten MSDIN-Loci assoziiert sind, die in einzelne 500-bp-Fenster fallen (obwohl wir diese Werte in den ergänzenden Ergebnissen und in Abb. S7 darstellen). Zukünftige Studien, die sich speziell mit Selektionsmustern befassen, sind erforderlich, um belastbare Beweise für die Trends zu liefern, die wir an einzelnen Orten identifizieren. Genomweite Muster in der Verteilung aller Schiebefenster zeigen eine positive Verschiebung in der Verteilung von Tajimas D in der kalifornischen Bevölkerung. Die Verschiebung kann auf den Verlust seltener Allele nach einem Gründerereignis hinweisen und darauf hindeuten, dass dem Bevölkerungswachstum nicht genügend Zeit zur Verfügung stand, um seltene Allele wiederherzustellen. Ein Median von Tajimas D aus europäischen Proben nahe Null steht im Einklang mit einem genetischen Gleichgewicht. Die Verteilung der genomweiten D-Messungen von Tajima (Abb. S7) unterstützt die natürliche Geschichte einer eingeführten kalifornischen Population und einer einheimischen europäischen Population, obwohl stichprobenbedingte und demografische Einflüsse nicht vollständig ausgeschlossen werden können (z. B. ungleichmäßige Stichprobenentnahme über die nicht realisierte Populationsstruktur). kann zu positiven Verschiebungen in Tajimas D führen – eine Erklärung, die wir für unsere geografisch begrenzte Stichprobe in Kalifornien als unwahrscheinlich erachten; Abb. S7, ergänzende Ergebnisse) [21].

Größere Buchstaben im Sequenzlogo entsprechen einer größeren Häufigkeit des spezifischen Aminosäurerests an einer bestimmten Stelle. Mithilfe der in PAML berechneten dN/dS-Verhältnisse (über den Logos angezeigt) haben wir eine Auswahl abgeleitet, die auf Leader-, Core- und Follower-Teile von MSDINs und über ganze Sequenzen wirkt. Wir konnten die Selektion, die auf A. phalloides-Kernsequenzen (unten, Mitte) wirkt, nicht messen, da in dieser hochgradig diversifizierten Region informative Stellen gesättigt sind.

MSDIN-Sequenzen besitzen im Vergleich zu anderen Genen im A. phalloides-Referenzgenom eine sehr geringe Anzahl effektiver Codons (Abb. S8), und eine Hypothese legt nahe, dass die auf MSDIN-Gene wirkende Selektion die MSDIN-Codons optimiert hat [71]. Muster in MSDIN-Genen spiegeln jedoch nicht konsistent genomweite Muster der Codon-Verzerrung wider (Abb. S8), und wir schlagen vor, dass es möglicherweise andere Erklärungen gibt. Die unterschiedliche Codon-Nutzung kann eine Koregulierung von Genen ermöglichen [72] und kann zur Diversität der resultierenden Aminosäuresequenzen beitragen, indem die Mutationsraten erhöht werden [73]. Letztere Funktion wurde für zyklische Peptide aus Kegelschneckengiften vorgeschlagen [74]. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um die Bedeutung der Codon-Verwendung in MSDIN-Sequenzen zu klären.

Um die physische Verteilung von MSDINs zu dokumentieren, die aus Erweiterungen der MSDIN-Genfamilie in Amanita spp. resultieren. Wir verwendeten zunächst 100-kb-Fenster, um das Referenzgenom von A. phalloides zu scannen. Wir identifizierten zwei Fenster mit jeweils zwei MSDIN-Loci, drei Fenster mit jeweils drei Loci und zwei Fenster mit jeweils sechs Loci (Tabelle S6). Insgesamt sind MSDIN-Loci physisch geclustert (binomialer Ausdruck, p < 0,000001). Wir verglichen den beobachteten mittleren Abstand zwischen MSDIN-Loci mit einer randomisierten Verteilung und bestätigten, dass MSDIN-Loci deutlich näher beieinander liegen, als dies durch Zufall erklärt werden kann (p < 0,001) (Abb. 3). Darüber hinaus sind MSDIN-Sequenzen, die an physisch geclusterten Loci kodiert werden, enger miteinander verwandt als mit Sequenzen an weiter entfernten Loci, d die Intronsequenzen allein (p = 0,002, r = 0,49) (Abb. 3).

ein Maximum-Likelihood-Baum, der die genetischen Beziehungen zwischen MSDIN-Kernsequenzen von vier Gattungen darstellt, die aus Sequenzen voller Länge einschließlich des Introns ermittelt wurden. Der Baum wurzelt beim früh divergenten Pilz Clavaria fumosa, um bekannte Beziehungen zwischen den Arten widerzuspiegeln. Bootstrap-Unterstützungswerte sind für eine Teilmenge von Knoten enthalten, um hervorzuheben, dass Topologien innerhalb der Gruppe, die Amanita spp. enthält. MSDINs werden nicht vollständig aufgelöst. Einige Amanita spp. wurden aus Gründen der Lesbarkeit weggelassen. Ein vollständiger Satz von Bootstraps-Werten für alle MSDINs aller Arten ist in Abb. S9 dargestellt. Die Spitzen sind farblich so gekennzeichnet, dass sie mit b übereinstimmen. Ein Beispiel für eine einzelne Region, die mehrere MSDIN-Loci kodiert, die sowohl im A. phalloides- als auch im A. subjunquillea-Genom kolokalisiert sind. c Permutationsanalyse der physischen Abstände zwischen MSDIN-Loci in A. phalloides zeigt, dass der beobachtete Abstand zwischen MSDINs (rot) deutlich kleiner als eine Nullverteilung (blau) ist (p < 0,001, wie durch die gestrichelte Linie angezeigt). d Genetische Abstände von den gesamten MSDIN-kodierenden (links) oder Intron- (rechts) Sequenzen korrelieren signifikant mit physischen Abständen (für Korrelationstest p < 0,001 r = 0,6, p = 0,002 bzw. r = 0,49; für Best-Fit-Linien). R2 = 0,414 bzw. R2 = 0,349).

Die MSDIN-Loci anderer Arten sind ebenfalls physisch geclustert. In Lepiota venenata befinden sich zwei neue MSDIN-Sequenzen (siehe unten) innerhalb von 5 kb voneinander. Fünf Contigs in A. bisporigera kodierten jeweils zwei oder mehr MSDIN-Loci innerhalb von 15 kb, obwohl unsere Fähigkeit, MSDIN-Loci in diesem Genom abzubilden, durch eine umfangreiche Sequenzfragmentierung behindert wurde. Im hochwertigen Genom von Amanita subjunquillea haben wir vier Genomregionen mit physisch geclusterten Loci identifiziert, darunter eine Region, die fünf MSDINs innerhalb von ~13 kb kodiert. Die Ausrichtung der A. subjunquillea- und A. phalloides-Anordnungen ergab, dass diese Region ortholog zu einer ~25 kb-Region im A. phalloides-Referenzgenom ist, das sechs MSDIN-Loci kodiert (Abb. 3). In dieser Region fehlt der IRLPPLFLPP-Locus aus der A. phalloides-Referenz im A. subjunquillea-Genom. Mindestens eines von zwei Allelen an diesem Locus ist in allen A. phalloides-Isolaten vorhanden (Abb. 1). Ob es intraspezifische Variationen beim Vorhandensein dieses Locus in A. subjunquillea gibt, ob er aus A. subjunquillea verloren gegangen ist oder ob er sich nach der Divergenz dieser beiden Abstammungslinien in A. phalloides entwickelt hat, bleibt offene Frage.

Phylogenetische Analyse von MSDIN-Sequenzen aus Amanita spp. und Lepiota deutet auf eine dynamische Evolutionsgeschichte hin. Während kodierende Sequenzen möglicherweise einer Selektion unterliegen, sind MSDIN-Intronsequenzen zu kurz (52–58 bp), um eine zuverlässige phylogenetische Auflösung zu ermöglichen. Daher haben wir uns für die Verwendung von End-to-End-Sequenzen entschieden, die sowohl kodierende Sequenzen als auch Introns umfassen. In dieser Phylogenie bildeten die MSDINs verschiedener Gattungen diskrete Gruppen (Abb. 3 und S9), was darauf hindeutet, dass Genfamilienerweiterungen in jeder Gattung unabhängig voneinander erfolgten. Die geclusterten Sequenzen von α-Amanitin von L. venenata und G. marginata bilden die einzige Ausnahme vom allgemeinen Muster.

Die Genome aller bekannten MSDIN-produzierenden Pilze kodieren für zwei Prolyl-Oligopeptidase (POP)-Enzyme. Das erste Gen, POPA, ist möglicherweise in Agaricales weit verbreitet und fungiert vermutlich als proteolytisches Haushaltsgen (eine von Walton [33] vorgeschlagene Hypothese). Allerdings sind die unter Agaricales spp. vorkommenden Prolyloligopeptidasen. ist möglicherweise nicht ortholog [37]. Das zweite Gen, POPB, wurde bisher nur in MSDIN-produzierenden Arten gefunden, wo es für die Reifung des MSDIN-Proproteins erforderlich ist. Wir haben POPB-Orthologe in allen verfügbaren Genomen zuvor identifizierter MSDIN-produzierender Arten bestätigt (Abb. 4). Wir haben auch ein POPB-Orthologe im Genom von Amanita polypyramis identifiziert (Abb. 4), das erste Mal, dass ein POPB-Gen innerhalb der Gattung Amanita, jedoch außerhalb der monophyletischen Gruppe der „tödlichen Amanitas“ gefunden wurde (33). Darüber hinaus haben wir ein POPB-Gen in Clavaria fumosa entdeckt, einem früh divergierenden Agaricales-Pilz. Die phylogenetische Analyse bestätigte die Identität von POPA und POPB in allen Arten, in denen sie gefunden wurden (Abb. S2). Unsere Analysen zeigen auch, dass einige Arten über erweiterte Sätze von POP-Genen verfügen, darunter einige, die eng mit POPB verwandt sind (Abb. S2), was darauf hindeutet, dass die Erweiterung der POP-Genfamilie ein weiteres Ziel für zukünftige Forschung ist. Eine kleine, früh divergierende Untergruppe innerhalb der größeren POPB-Gruppe enthält eine einzelne Amanita brunnescens-Sequenz (Abb. S2). Alle anderen Arten mit Vertretern in dieser Untergruppe verfügen über zusätzliche POPB-Sequenzen, die innerhalb der größeren POPB-Gruppe verschachtelt sind (z. B. A. phalloides hat zwei mutmaßliche POPB-Sequenzen), was Fragen zur Funktionalität dieser Gene aufwirft. Weitere Arbeiten sind erforderlich, um die möglichen Funktionen und die Entwicklung von POP-Genen in Genomen ohne MSDIN-Sequenzen zu klären.

a Ein UpSet-Diagramm, das die Überlappung der MSDIN-Kernsequenzen zwischen Arten basierend auf unseren Analysen und zuvor veröffentlichten Ergebnissen darstellt (Tabellen S2 und S4). Die Satzgröße spiegelt die Gesamtzahl der eindeutigen MSDIN-Kernsequenzen wider, die für alle Genome einer Art gemeldet wurden. Unterschiede in dieser Metrik sollten mit Vorsicht interpretiert werden, da sich Arten in der Anzahl der verfügbaren Genome unterscheiden können. Die Schnittgröße stellt die MSDINs dar, die in den Arten vorhanden sind, die mit einem oder mehreren schwarzen Kreisen unter jeder Spalte markiert sind (z. B. hat Amanita bisporigera 26 MSDINs, die bei anderen Arten nicht vorkommen; der MSDIN IWGIGCNP (α-Amanitin) kommt in allen Arten außer Clavaria vor fumosa und Amanita polypyramis). Aus veröffentlichten Studien identifizierte MSDINs wurden nicht erneut validiert. b Phylogenetische Beziehungen von MSDIN-produzierenden Arten über Agaricales hinweg, bestimmt aus dem Konsens von 289 Maximum-Likelihood-Bäumen der Proteinsequenzen von Einzelkopie-Orthologen (d. h. BUSCOs). Die Länge der Endabzweige wird nicht berechnet. Alle Knoten, die Arten trennen, haben A-Posteriori-Wahrscheinlichkeiten über 0,93. Das Vorhandensein des MSDIN-assoziierten Verarbeitungsenzyms POPB und die Anzahl der MSDIN-Sequenzen werden im inneren bzw. äußeren Ring dargestellt. Während wir 249 Genome nach MSDINs durchsuchten (Tabelle S3), umfasst der Baum nur taxonomische Familien mit Arten, bei denen festgestellt wurde, dass sie mindestens ein MSDIN und POPB aufweisen. Genome, bei denen festgestellt wurde, dass sie sowohl MSDIN- als auch POPB-Gene aufweisen, werden mit einem Stern hervorgehoben, wobei die Größe des Sterns auch die gesamte in jeder Art gefundene MSDIN-Anzahl widerspiegelt. † Diese MSDIN-Sequenzen sind mit reifen Produkten mit charakterisierter Bioaktivität als Toxine verbunden. Von links nach rechts: Phalloidin (AWLATCP), Phallacidin (AWLVDCP), β-Amanitin (IWGIGCDP) und α-Amanitin (IWGIGCNP). * Das Genom von Amanita brunnescens, einer Art ohne MSDINs, kodiert eine Sequenz, die in einer kleinen und früh divergenten POPB-Subklasse gefunden wird (Abb. S2). Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um zu klären, ob dieses Gen funktionsfähig ist.

In Übereinstimmung mit unserer Entdeckung der POPB-Gene kodieren die Genomen von A. polypyramis und C. fumosa jeweils ein einzelnes, bisher nicht identifiziertes MSDIN (MSDINATRLP FLPPILP HYAPDDVNYTMLSDSLC bzw. MFDTNDTRVP NWAGFFGWP CSPDTAGDTLNRGKDLC) (Abb. 4). Wir halten die Identifizierung eines zweiten mutmaßlichen MSDIN im A. polypyramis-Genom (MSNVNATRIP GPRPLAFP FFGDEENNALNCGESLC) aufgrund der minderwertigen Sequenz in seiner Kern- und Folgeregion für nicht schlüssig. Während diesen beiden Genomen das kanonische α-Amanitin-Gen zu fehlen scheint, kann sein offensichtliches Fehlen durch unvollständige Genomassemblierungen verursacht werden.

Das α-Amanitin-Gen wurde als einziges MSDIN in L. venenata beschrieben [40], aber Walton [33] berichtete in seinem Buch über sechs MSDIN-Gene in Lepiota subincarnata. Wir identifizierten zwei weitere MSDIN-Sequenzen (MSDANNTRLP FFVPGLPFPP WTGENADHILARSKDLC und MSDANNTRLP FFAPGLPFPP WTGENADHILARSKDLC) im veröffentlichten [40] L. venenata-Genom (Abb. 4) zusätzlich zum α-Amanitin-Gen (MDANATRLP IWGIGCNP WTPESVNDTLTKDLS). Diese Sequenzen wurden auch von Luo et al. identifiziert. [38] und durch korrektes Parsen von Introns haben unsere Ergebnisse Follower-Sequenzen aufgelöst. Eine vierte MSDIN-Sequenz (MSDLNNTRLP VVTVLFTPPP WSGESVDHSLTRSKDLC), die sich innerhalb von 2 kb dieser Sequenzen befindet, wurde nur gefunden, als der mögliche Intronbereichsparameter unserer Skripte um 30 bp erhöht wurde. Es ist unklar, ob die lange Intronlänge dieses MSDIN biologisch relevant ist oder ob dieses Ergebnis einen Sequenzierungsfehler widerspiegelt, da es in den entsprechenden Sequenzdaten einen Abschnitt mit einer minderwertigen Sequenz von ca. 30 bp gibt. Unser Ergebnis unterstreicht die Nützlichkeit unserer automatisierten MSDIN-Suchpipeline. Es kann sowohl MSDINs in großem Umfang identifizieren als auch zuvor übersehene Sequenzen erkennen.

Die dynamische Entwicklung von Toxin-Genen bei Knollenblätterpilzen in Kalifornien und Europa lässt auf Toxizität schließen, und das Vorhandensein oder Fehlen von MSDINs ist nicht neutral: Verschiedene Individuen besitzen unterschiedliche Genreihen, Gene führen zu messbaren Phänotypen und zumindest einigen Sequenzen (einschließlich der Sequenzkodierung). das paradigmatische MSDIN α-Amanitin) unterliegen einer starken natürlichen Selektion. Laufende Verbreitungserweiterungen [75] unterstreichen die dringende Notwendigkeit, die ökologische Rolle der vom Pilz in einheimischen und eingedrungenen Lebensräumen produzierten Toxine zu verstehen. Unsere bioinformatische MSDIN-Erkennungspipeline klärt Muster nicht nur innerhalb von A. phalloides, sondern auch innerhalb der Agaricales auf und schafft so eine solide Grundlage für zukünftige Experimente, einschließlich Tests sowohl der „Feindfreisetzungs“-Hypothese (76) als auch der neuartigen Waffenhypothese (31). .

Zyklische Peptide und strukturell analoge Verbindungen, die den Toxinen der Knollenblätterpilze ähneln, kommen in den Giften mehrerer Tierarten vor, darunter Kegelschnecken, Schlangen und Spinnen [33], ein eindrucksvolles Beispiel für konvergente Evolution. Bei Tieren wird die Giftdiversifizierung häufig auf Selektionsdruck zurückgeführt, der durch die unterschiedliche Anfälligkeit verschiedener Beutetiere gegenüber bestimmten Toxinen entsteht [77, 78], und die Anzahl der Giftbestandteile hängt mit der Ernährungsvielfalt zusammen [79]. Unsere Daten deuten auf eine ähnliche Dynamik für den Selektionsdruck hin, der auf MSDIN-Gene wirkt (Abb. 2). Während die Leader- und Follower-Regionen der MSDIN-Genfamilie von A. phalloides einer starken reinigenden Selektion unterliegen, diversifizieren sich die Kernregionen. Die Kernregionen sind so vielfältig, dass wir die Sequenzen nicht ausrichten und klären konnten, ob die Diversität auf neutraler Evolution oder positiver Selektion beruht. Während die Kernsequenzen als Gruppe vielfältig sind, sind einige Kernsequenzen gattungsübergreifend konserviert (Abb. 4a), beispielsweise α-Amanitin. Eine starke reinigende Selektion wirkt sich eindeutig auf die Sequenz aus, die für α-Amanitin kodiert (Abb. 2). Akzessorische Genombestandteile können durch relativ seltene oder inkonsistent verteilte Selektionsdrücke erhalten bleiben, während Kerngenombestandteile möglicherweise weit verbreitete Selektionsdrücke widerspiegeln, die im gesamten Verbreitungsgebiet der Knollenblätterpilze vorkommen. Es wird angenommen, dass die Allelfrequenzen giftiger Gene in Schlangen in einigen Populationen adaptiv sind und die Giftdiversifizierung durch eine ausgewogene Selektion zwischen Gruppen vorantreiben [80]. Wir spekulieren, dass die Selektion auf MSDINs aus der Interaktion zwischen spezifischen Genprodukten (z. B. Redundanz, Synergie und Dichteabhängigkeit) und der Anpassung an lokale ökologische Bedingungen (z. B. Pilzpopulationen) resultiert. Obwohl das MSDIN-Kerngenom die meisten der berüchtigten MSDIN-Toxine enthält, bleibt die Bioaktivität der meisten Kern- und akzessorischen MSDINs unbekannt; Eine Teilmenge der MSDINs hat möglicherweise keine ökologische Funktion [81]. Bis die Funktion von MSDINs in der Natur definiert ist, wird ein ganzheitliches Verständnis ihrer Entwicklung unerreichbar bleiben.

Die Evolutionsgeschichte von MSDINs unter Agaricales-Pilzen (Abb. 3 und 4) weist auch auffällige Parallelen zur Entwicklung von Knottinen auf, einer Cycloamanid-ähnlichen Gruppe von Verbindungen in Spinnengiften. Es wird angenommen, dass ein gemeinsamer Vorfahre von Knottin mehrere unabhängige Diversifizierungsereignisse unter den Spinnenarten durchlaufen hat [82]. In ähnlicher Weise lässt die deutliche Häufung von MSDIN-Sequenzen aus verschiedenen Gattungen (wir beachten jedoch die Ausnahme der α-Amanitin-Sequenzen von L. venenata und G. marginata) darauf schließen, dass die MSDIN-Diversifizierung unabhängig voneinander bei Lepiota und Amanita erfolgte (Abb. 3). Für die Diversifizierung von Knottinen wurde eine Genduplikation und anschließende positive Selektion vorgeschlagen [83]. Eng verwandte MSDIN-Gene liegen im Genom physisch nahe beieinander (Abb. 3), was darauf hindeutet, dass Duplikation und anschließende Divergenz ein Mechanismus sind, der die Entstehung neuer Gene auch im Amanita antreibt [84]. Es wird angenommen, dass der gemeinsame Vorfahre von Knottin eine Disulfidbindung besaß, die eine starke Bioaktivität verleiht [82]. In ähnlicher Weise wird die Wirksamkeit von α-Amanitin einer Tryptathionin-Bindung zwischen Cystein und Tryptophan zugeschrieben; α-Amanitin gilt als Vorläufer aller bekannten MSDIN-Sequenzen [33]. Sowohl in Knottinen als auch in MSDINs sind die chemischen Brücken nicht in allen Nachkommen der angestammten Toxine vorhanden. Unsere Ergebnisse verdeutlichen die bemerkenswerten Parallelen zwischen Pilzen und Tieren und veranschaulichen gemeinsame Verläufe in der Evolutionsgeschichte konvergent entwickelter, aber strukturell ähnlicher Verbindungen.

Walton (2018) schlägt die diskontinuierliche Verteilung der MSDIN-Gene über Agaricales spp. vor. (Abb. 4) ist ein Ergebnis des horizontalen Gentransfers (HGT), da die alternative Hypothese eines umfassenden Genverlusts nur schwer mit der starken Bioaktivität der Gene in Einklang zu bringen ist. Unter Amanita spp. wurden MSDIN-Gene nur innerhalb der monophyletischen Gruppe der tödlichen Amanita beschrieben (85). Unser Fund sowohl eines POPB- als auch eines MSDIN-Gens im Genom von A. polypyramis (einer Art außerhalb der tödlichen Amanita-Klade) verschiebt entweder den Zeitpunkt, zu dem MSDINs auf Amanita übertragen wurden, erheblich nach hinten, was einen weiteren Rückschluss auf einen Genverlust erforderlich macht (oder unvollständig ist). Abstammungssortierung) oder deutet auf das Auftreten eines zusätzlichen HGT zwischen A. polypyramis und einem anderen Organismus hin. Das MSDIN von A. polypyramis nistet sich innerhalb der Amanita-Klade der MSDIN-Sequenzen ein (Abb. 3), was darauf hindeutet, dass sich diese Sequenz möglicherweise irgendwann nach Beginn der tödlichen Erweiterung der Amanita-Genfamilie entwickelt hat. Die Häufung des A. polypyramis-MSDIN mit anderen Amanita-MSDINs ist phylogenetisch inkompatibel mit der Evolutionsgeschichte der Gattung (Abb. 3 und 4) und weist auf ein HGT-Ereignis innerhalb von Amanita hin, obwohl wir die Bootstrap-Unterstützungswerte für seine Position und die hervorheben Kurze Sequenzen, die der Phylogenie zugrunde liegen, lassen die Möglichkeit offen, dass wahre Beziehungen zwischen diesen MSDINs mit der vertikalen Übertragung übereinstimmen. Phylogenetische Beziehungen, die aus der längeren Sequenz des POPB-Proteins abgeleitet werden, sind sowohl mit der vertikalen als auch der horizontalen Übertragung innerhalb der Gattung kompatibel, da eine Übertragung auf A. polypyramis möglicherweise vor der Artbildung der tödlichen Amanita-Klade stattgefunden hat (Abb. S2). Die phylogenetischen Beziehungen der in C. fumosa gefundenen MSDIN- und POPB-Gene sind phylogenetisch mit unserem Artenbaum kompatibel, was darauf hindeutet, dass die Gene möglicherweise einen älteren Ursprung haben als bisher angenommen (Abb. S2). Weitere Daten sind erforderlich, um die Fragen zu klären, die unsere Ergebnisse zur Evolutionsgeschichte der MSDIN- und POP-Gene aufwerfen.

Die komplexen Lebenszyklen, Ploidie und technischen Schwierigkeiten, die mit der Züchtung und Manipulation von Basidiomyceten im Labor verbunden sind, haben die Entwicklung von Werkzeugen zur Identifizierung von Basidiomyceten-SMs verlangsamt und gezielte Experimente ausgeschlossen. Eine kürzlich durchgeführte Untersuchung des Pilzreichs betont, dass Basidiomycota ein Stamm ist, der einen einzigartigen Satz wenig erforschter arzneimittelähnlicher Verbindungen beherbergt [86]. Unsere bioinformatische Pipeline zur MSDIN-Suche ermöglicht die Arzneimittelsuche innerhalb einer bisher unzugänglichen Klasse von Basidiomyceten-spezifischen SM und bietet einen Fahrplan für die Entwicklung ähnlicher Pipelines in der Zukunft.

Sequenzdaten für alle hier verwendeten A. phalloides-Proben werden von Wang et al. zur Verfügung gestellt. [45]. Die Daten für alle anderen Analysen sind bereits öffentlich und werden im Text entsprechend referenziert, wobei Einzelheiten zu spezifischen Zugangsnummern in den ergänzenden Materialien verfügbar sind.

Skripte im Zusammenhang mit unserer bioinformatischen MSDIN-Suchpipeline sind auch in den ergänzenden Materialien verfügbar.

Sakai AK, Allendorf FW, Holt JS, Lodge DM, Molofsky J, With KA, et al. Die Populationsbiologie invasiver Arten. Annu Rev Ecol Syst. 2001;32:305–32.

Google Scholar

Allendorf FW, Lundquist LL. Einführung: Populationsbiologie, Evolution und Kontrolle invasiver Arten. Conserv Biol. 2003;17:24–30.

Google Scholar

Erickson AB. Die Ökologie der Invasionen von Tieren und Pflanzen. New York: Wiley; 1960.

Bäcker HG. Die Entwicklung des Unkrauts. Annu Rev Ecol Syst. 1974;5:1–24.

Google Scholar

Capellini I, Baker J, Allen WL, Street SE, Venditti C. Die Rolle lebensgeschichtlicher Merkmale für den Erfolg der Säugetierinvasion. Ecol Lett. 2015;18:1099–107.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Gladieux P, Feurtey A, Hood ME, Snirc A, Carnation J, Dutech C, et al. Die Populationsbiologie von Pilzinvasionen. Mol Ecol. 2015;24:1969–86.

CAS PubMed Google Scholar

Dutech C, Barres B, Bridier J, Robin C, Milgroom MG, Ravigne V. Die Welttournee mit Kastanienfäulepilzen: Aufeinanderfolgende Einführungsveranstaltungen unterschiedlicher Herkunft in einen invasiven Pflanzenpilzpathogen. Mol Ecol. 2012;21:3931–46.

CAS PubMed Google Scholar

Fisher MC, Garner TWJ. Chytrid-Pilze und globaler Amphibienrückgang. Nat Rev Microbiol. 2020;18:332–43.

CAS PubMed Google Scholar

Drees KP, Lorch JM, Puechmaille SJ, Parise KL, Wibbelt G, Hoyt JR, et al. Phylogenetik einer Pilzinvasion: Ursprünge und weite Verbreitung des Weißnasen-Syndroms. mBio. 2017;8:e01941–17.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Jeffery-Smith A, Taori SK, Schelenz S, Jeffery K, Johnson EM, Borman A, et al. Candida auris: eine Überprüfung der Literatur. Clin Microbiol Rev. 2018;31:e00029–17.

PubMed Google Scholar

Keller NP. Sekundärstoffwechsel von Pilzen: Regulierung, Funktion und Wirkstoffentwicklung. Nat Rev Microbiol. 2019;17:167–80.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Drott MT, Debenport T, Higgins SA, Buckley DH, Milgroom MG. Die Fitnesskosten der Aflatoxinproduktion in Aspergillus flavus im Wettbewerb mit Bodenmikroben könnten eine ausgewogene Selektion aufrechterhalten. mBio. 2019;10:e02782–18.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu L, Sasse C, Dirnberger B, Valerius O, Fekete-Szücs E, Harting R, et al. Sekundäre Metaboliten von Hülle-Zellen vermitteln den Schutz der Fortpflanzungs- und Überwinterungsstrukturen von Pilzen vor pilzfressenden Tieren. Elife. 2021;10:e68058.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Drott MT, Lazzaro BP, Brown DL, Carbone I, Milgroom MG. Die ausgleichende Selektion auf Aflatoxin in Aspergillus flavus wird durch Interferenzkonkurrenz mit und Pilzfresser durch Insekten aufrechterhalten. Proc R Soc B. 2017;284:20172408.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Drott MT, Satterlee TR, Skerker JM, Pfannenstiel BT, Glass NL, Keller NP, et al. Die Häufigkeit des Geschlechts: Die Populationsgenomik zeigt Unterschiede in der Rekombination und Populationsstruktur des Aflatoxin-produzierenden Pilzes Aspergillus flavus. mBio. 2020;11:e00963–20.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hu X, Xiao G, Zheng P, Shang Y, Su Y, Zhang X, et al. Flugbahn und genomische Determinanten der Pilz-Pathogen-Artbildung und Wirtsanpassung. Proc Natl Acad Sci USA. 2014;111:16796–801.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Raffa N, Hyung Won T, Sukowaty A, Candor K, Cui C, Halder S, et al. Von Aspergillus fumigatus produzierte Isocyanide mit doppeltem Verwendungszweck tragen zur zellulären Kupferversorgung bei und zeigen antimikrobielle Aktivität. Proc Natl Acad Sci USA. 2021;118:e2015224118.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lim S, Bijlani S, Blachowicz A, Chiang YM, Lee MS, Torok T, et al. Identifizierung des Pigments und seiner Rolle bei der UV-Resistenz in Paecilomyces variotii, einem Tschernobyl-Isolat, mithilfe genetischer Manipulationsstrategien. Pilzgenet Biol. 2021;152:103567.

CAS PubMed Google Scholar

Venkatesh N, Greco C, Drott MT, Koss MJ, Ludwikoski I, Keller NM, et al. Bakterielle Tramper profitieren von der Besiedlung durch Pilze. Curr Biol. 2022;32:1523–33.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Drott MT, Rush TA, Satterlee TR, Giannone RJ, Abraham PE, Greco C, et al. Mikroevolution im pansekundären Metabolom von Aspergillus flavus und ihre möglichen makroevolutionären Auswirkungen auf Fadenpilze. Proc Natl Acad Sci USA. 2021;118:e2021683118.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pringle A, Adams RI, Cross HB, Bruns TD. Der Ektomykorrhizapilz Amanita phalloides wurde eingeführt und erweitert sein Verbreitungsgebiet an der Westküste Nordamerikas. Mol Ecol. 2009;18:817–33.

CAS PubMed Google Scholar

Pringle A, Vellinga EC. Letzte Chance, es zu erfahren? Verwendung von Literatur zur Erforschung der Biogeographie und Invasionsbiologie des Knollenblätterpilzes Amanita phalloides (Vaill. ex Fr.:Fr.) Link. Biol-Invasionen. 2006;8:1131–44.

Google Scholar

Tedersoo L, Bahram M, Zobel M. Wie Mykorrhiza-Assoziationen die Pflanzenpopulation und die Gemeinschaftsbiologie beeinflussen. Wissenschaft. 2020;367:eaba1223.

CAS PubMed Google Scholar

Koide RT, Fernandez C, Malcolm G. Bestimmung von Ort und Prozess: funktionelle Merkmale von Ektomykorrhizapilzen, die sowohl die Gemeinschaftsstruktur als auch die Ökosystemfunktion beeinflussen. N Phytol. 2014;201:433–9.

Google Scholar

Jan S., Anna C., Antonín K., Jiří Š, Jan B., Tereza L. et al. Intrazelluläre Sequestrierung von Cadmium und Zink im Ektomykorrhizapilz Amanita muscaria (Agaricales, Amanitaceae) und Charakterisierung seines Metallothionein-Gens. Pilzgenet Biol. 2022;162:103717.

CAS PubMed Google Scholar

Lesen Sie DJ, Perez-Moreno J. Mykorrhiza und Nährstoffkreislauf in Ökosystemen – eine Reise zur Relevanz? N. Phytol. 2003;157:475–92.

CAS Google Scholar

Wolfe BE, Richard F, Cross HB, Pringle A. Verbreitung und Häufigkeit des eingeführten Ektomykorrhizapilzes Amanita phalloides in Nordamerika. N. Phytol. 2010;185:803–16.

Google Scholar

Ye Y, Liu Z. Management der Amanita phalloides-Vergiftung: eine Literaturübersicht und Aktualisierung. J Crit Care. 2018;46:17–22.

PubMed Google Scholar

Dickie IA, Nuñez MA, Pringle A, Lebel T, Tourtellot SG, Johnston PR. Auf dem Weg zur Bekämpfung invasiver Ektomykorrhizapilze. Biol-Invasionen. 2016;18:3383–95.

Google Scholar

Dickie IA, Martínez-García LB, Koele N, Grelet GA, Tylianakis JM, Peltzer DA, et al. Mykorrhiza und Mykorrhiza-Pilzgemeinschaften während der gesamten Ökosystementwicklung. Pflanzenerde. 2013;367:11–39.

CAS Google Scholar

Bais HP, Vepachedu R, Gilroy S, Callaway RM, Vivanco JM. Allelopathie und Invasion exotischer Pflanzen: Von Molekülen und Genen bis hin zu Arteninteraktionen. Wissenschaft. 2003;301:1377–80.

CAS PubMed Google Scholar

Vivanco JM, Bais HP, Stermitz FR, Thelen GC, Callaway RM. Biogeografische Variation in der Reaktion der Gemeinschaft auf Wurzelallelochemie: Neuartige Waffen und exotische Invasion. Ecol Lett. 2004;7:285–92.

Google Scholar

Walton J. Die zyklischen Peptidtoxine von Amanita und anderen giftigen Pilzen. Berlin: Springer; 2018.

Hallen HE, Luo H, Scott-Craig JS, Walton JD. Genfamilie, die die Haupttoxine tödlicher Amanita-Pilze kodiert. Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104:19097–101.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luo H, Hong SY, Sgambelluri RM, Angelos E, Li X, Walton JD. Peptidmakrocyclisierung, katalysiert durch eine Prolyloligopeptidase, die an der α-Amanitin-Biosynthese beteiligt ist. Chem. Biol. 2014;21:1610–7.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou S, Li X, Lüli Y, Li X, Chen ZH, Yuan P, et al. Neuartige zyklische Peptide aus tödlichen Amanita-Pilzen durch einen genomgesteuerten Ansatz. J Pilze. 2021;7:204.

CAS Google Scholar

Luo H, Cai Q, Lüli Y, Li X, Sinha R, Hallen-Adams HE, et al. Die MSDIN-Familie in Amanitin-produzierenden Pilzen und Entwicklung der Prolyl-Oligopeptidase-Gene. IMA-Pilz. 2018;9:225–42.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Luo H, Hallen-Adams HE, Lüli Y, Sgambelluri RM, Li X, Smith M, et al. Gene und evolutionäre Schicksale des Amanitin-Biosynthesewegs in giftigen Pilzen. Proc Natl Acad Sci USA. 2022;119:e2201113119.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Luo H, Hallen-Adams HE, Scott-Craig JS, Walton JD. Ribosomale Biosynthese von α-Amanitin in Galerina marginata. Pilzgenet Biol. 2012;49:123–9.

CAS PubMed Google Scholar

Lüli Y, Cai Q, Chen ZH, Sun H, Zhu XT, Li X, et al. Genom der tödlichen Lepiota venenata und Einblicke in die Evolution toxinbiosynthetischer Gene. BMC-Genom. 2019;20:198.

Google Scholar

He Y, Zhang C, Deng W, Zhou X, Li T, Li C. Transkriptomsequenzierungsanalyse der MSDIN-Genfamilie, die zyklische Peptide in tödlichen Amanita fuligineoides kodiert. Toxikon. 2020;183:61–68.

CAS PubMed Google Scholar

Lüli Y, Zhou S, Li X, Chen Z, Yang Z, Luo H. Differenzielle Expression von Amanitin-Biosynthesegenen und neuen zyklischen Peptiden in Amanita molliuscula. J Pilze. 2021;7:384.

Google Scholar

Pulman JA, Childs KL, Sgambelluri RM, Walton JD. Erweiterung und Diversifizierung der msdin-Familie zyklischer Peptidgene in den giftigen Pilzen Amanita phalloides und A. bisporigera. BMC-Genomik. 2016;17:1038.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Elmore H. Ökologische Populationsgenomik im entstehenden Amanita-System, Doktorarbeit. Cambridge: Harvard University; 2020.

Wang Y, McKeon MC, Elmore H, Hess J, Gage H, Gonçalves SC, et al. Invasive Kalifornische Knollenblätterpilze entwickeln Pilze und sporulieren eingeschlechtlich und bisexuell. bioRxiv. 2023 https://doi.org/10.1101/2023.01.30.525609.

van der Auwera GA, O'Connor BD. Genomik in der Cloud: Verwendung von Docker, GATK und WDL in Terra. Sebastopol: O'Reilly Media; 2020.

Bushnell B. BBMap: ein schneller, genauer und spleißbewusster Aligner. Berkeley: Lawrence Berkeley National Lab; 2014.

Bankevich A, Nurk S, Antipov D, Gurevich AA, Dvorkin M, Kulikov AS, et al. SPAdes: ein neuer Genomassemblierungsalgorithmus und seine Anwendungen für die Einzelzellsequenzierung. Computerbiol. 2012;19:455–77.

CAS Google Scholar

Camacho C, Coulouris G, Avagyan V, Ma N, Papadopoulos J, Bealer K, et al. BLAST+: Architektur und Anwendungen. BMC Bioinform. 2009;10:421.

Google Scholar

Bailey TL, Johnson J, Grant CE, Noble WS. Die MEME-Suite. Nukleinsäuren Res. 2015;43:W39–W49.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li H, Durbin R. Schnelle und genaue Ausrichtung kurzer Lesevorgänge mit Burrows-Wheeler-Transformation. Bioinformatik. 2009;25:1754–60.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Quinlan AR. BEDTools: das Schweizer Armee-Tool zur Analyse von Genommerkmalen. Aktuelles Protokoll Bioinform. 2014;47:1–34. 11.12

Google Scholar

Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, et al. Das Sequenzausrichtungs-/Kartenformat und SAMtools. Bioinformatik. 2009;25:2078–9.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Danecek P, Auton A, Abecasis G, Albers CA, Banks E, DePristo MA, et al. Das Variantenaufrufformat und VCFtools. Bioinformatik. 2011;27:2156–8.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): Hochleistungsvisualisierung und -exploration von Genomdaten. Kurzes Bioinform. 2013;14:178–92.

PubMed Google Scholar

Wickham H. ggplot2. Wiley Interdiscip Rev Comput Stat. 2011;3:180–5.

Google Scholar

Yu G, Smith DK, Zhu H, Guan Y, Lam TTY. ggtree: ein R-Paket zur Visualisierung und Annotation phylogenetischer Bäume mit ihren Kovariaten und anderen zugehörigen Daten. Methoden Ecol Evol. 2017;8:28–36.

Google Scholar

Xu S, Dai Z, Guo P, Fu X, Liu S, Zhou L, et al. GgtreeExtra: Kompakte Visualisierung reich annotierter phylogenetischer Daten. Mol Biol Evol. 2021;38:4039–42.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Simão FA, Waterhouse RM, Ioannidis P, Kriventseva EV, Zdobnov EM. BUSCO: Beurteilung der Vollständigkeit der Genomassemblierung und Annotation mit Einzelkopie-Orthologen. Bioinformatik. 2015;31:3210–2.

PubMed Google Scholar

Katoh K, Standley DM. MAFFT Multiple Sequence Alignment-Software Version 7: Verbesserungen bei Leistung und Benutzerfreundlichkeit. Mol Biol Evol. 2013;30:772–80.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nguyen LT, Schmidt HA, von Haeseler A, Minh BQ. IQ-TREE: ein schneller und effektiver stochastischer Algorithmus zur Schätzung von Phylogenien mit maximaler Wahrscheinlichkeit. Mol Biol Evol. 2015;32:268–74.

CAS PubMed Google Scholar

Zhang C, Rabiee M, Sayyari E, Mirarab S. ASTRAL-III: Polynomialzeit-Artenbaumrekonstruktion aus teilweise aufgelösten Genbäumen. BMC Bioinform. 2018;19:15–30.

Google Scholar

Conway JR, Lex A, Gehlenborg N. UpSetR: ein R-Paket zur Visualisierung sich überschneidender Mengen und ihrer Eigenschaften. Bioinformatik. 2017;33:2938–40.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stanke M, Diekhans M, Baertsch R, Haussler D. Verwendung nativer und syntenisch kartierter cDNA-Alignments zur Verbesserung der De-novo-Gensuche. Bioinformatik. 2008;24:637–44.

CAS PubMed Google Scholar

Pfeifer B, Wittelsbürger U, Ramos-Onsins SE, Lercher MJ. PopGenome: ein effizientes Schweizer Taschenmesser für populationsgenomische Analysen in R. Mol Biol Evol. 2014;31:1929–36.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Peakall R, Smouse PE. GENALEX 6: genetische Analyse in Excel. Populationsgenetische Software für Lehre und Forschung. Mol Ecol-Notizen. 2006;6:288–95.

Google Scholar

Kamvar ZN, Tabima JF, Grünwald NJ. Poppr: Ein R-Paket zur genetischen Analyse von Populationen mit klonaler, teilweise klonaler und/oder sexueller Fortpflanzung. PeerJ. 2014;2:e281.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Suyama M, Torrents D, Bork P. PAL2NAL: Robuste Umwandlung von Proteinsequenz-Alignments in die entsprechenden Codon-Alignments. Nukleinsäuren Res. 2006;34:W609–W612.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang Z. PAML 4: Phylogenetische Analyse nach Maximum Likelihood. Mol Biol Evol. 2007;24:1586–91.

CAS PubMed Google Scholar

Kryazhimskiy S, Plotkin JB. Die Populationsgenetik von dN/dS. PLoS Genet. 2008;4:e1000304.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Li P, Deng W, Li T. Die molekulare Vielfalt der Toxin-Genfamilien in tödlichen Amanita-Pilzen. Toxikon. 2014;83:59–68.

CAS PubMed Google Scholar

Plotkin JB, Robins H, Levine AJ. Gewebespezifische Codon-Nutzung und Expression menschlicher Gene. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101:12588–91.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wagner SD, Milstein C, Neuberger MS. Der Codon-Bias zielt auf Mutationen ab. Natur. 1996;376:732–32.

Google Scholar

Conticello SG, Pilpel Y, Glusman G, Fainzilber M. Positionsspezifische Codonkonservierung in hypervariablen Genfamilien. Trends Genet. 2001;16:57–59.

Google Scholar

Moor-Smith M, Li R, Ahmad O. Der giftigste Pilz der Welt, Amanita phalloides, wächst in BC. BC Med J. 2019;61:20–24.

Google Scholar

Maron JL, Vilà M. Wann beeinflussen Pflanzenfresser die Pflanzeninvasion? Beweise für die Hypothesen der natürlichen Feinde und der biotischen Resistenz. Oikos. 2001;95:361–73.

Google Scholar

Wong ESW, Belov K. Giftentwicklung durch Genduplikationen. Gen. 2012;496:1–7.

CAS PubMed Google Scholar

Lyons K, Dugon MM, Healy K. Die Breite der Ernährung beeinflusst die Beutespezifität der Giftstärke bei Schlangen. Giftstoffe. 2020;12:74.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Phuong MA, Mahardika GN, Alfaro ME. Die Vielfalt der Nahrung korreliert positiv mit der Giftkomplexität bei Kegelschnecken. BMC-Genom. 2016;17:401.

Google Scholar

Schild DR, Perry BW, Adams RH, Holding ML, Nikolakis ZL, Gopalan SS, et al. Die Rolle des Gleichgewichts zwischen Selektion und Rekombination bei der Entwicklung des Klapperschlangengifts. Nat Ecol Evol. 2022;6:1367–80.

PubMed Google Scholar

Gould SJ, Lewontin RC. Die Zwickel von San Marco und das panglossische Paradigma: eine Kritik des adaptionistischen Programms. Proc R Soc. Lond B. 1979;205:581–98.

CAS Google Scholar

Pineda SS, Chin Y, Undheim EA, Senff S, Mobli M, Dauly C, et al. Strukturelle Giftanalysen zeigen die Entwicklung eines komplexen Giftes durch Duplikation und Diversifizierung eines alten peptidkodierenden Gens. Proc Natl Acad Sci USA. 2020;117:11399–408.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rodríguez De La Vega RC. Eine Anmerkung zur Entwicklung von Spinnentoxinen, die das ICK-Motiv enthalten. Toxin Rev. 2005;24:383–95.

Google Scholar

Wang Y, Hess J, Slot JC, Pringle A. De-novo-Gengeburt, horizontaler Gentransfer und Genduplikation als Quellen neuer Genfamilien, die mit dem Ursprung der Symbiose bei Amanita verbunden sind. Genome Biol Evol. 2020;12:2168–82.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cai Q, Tulloss RE, Tang LP, Tolgor B, Zhang P, Chen ZH, et al. Multi-Locus-Phylogenie tödlicher Amanitas: Auswirkungen auf die Artenvielfalt und die historische Biogeographie. BMC Evol Biol. 2014;14:143.

PubMed PubMed Central Google Scholar

Robey MT, Caesar LK, Drott MT, Keller NP, Kelleher NL. Ein interpretierter Atlas biosynthetischer Gencluster aus 1.000 Pilzgenomen. Proc Natl Acad Sci USA. 2021;118:e2020230118.

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Unsere Forschung wurde durch die Pionierarbeit von Dr. Jonathan Walton (1953–2018) ermöglicht, und wir widmen ihm unsere Arbeit. Wir sind auch dankbar für die Unterstützung durch das Molecular and Environmental Toxicology Postdoctoral Training Program der University of Wisconsin – Madison (UW), finanziert durch das NIH-Stipendium T32 ES007015 (vergeben an MTD), die National Institutes of Health R01 2R01GM112739-05A1 an NPK und die Fulbright US Scholar-Stipendium für AP. Die Genomsequenzierung wurde durch Mittel aus einem an AP vergebenen Zuschuss RGP0053 des Human Frontier Science Program ermöglicht. Diese Forschung wurde mit den Rechenressourcen und der Unterstützung des Madison Center for High Throughput Computing (CHTC) der University of Wisconsin im Fachbereich Informatik durchgeführt; Besonders dankbar sind wir für die aufmerksame und geduldige Unterstützung von Christina Koch. Wir danken Sarah Friedrich für ihr scharfes Auge und ihre Unterstützung bei der Darstellung der Figuren. Die Autoren nutzten die DNA-Sequenzierungsanlage (Research Resource Identifier – RRID:SCR_017759) des University of Wisconsin-Madison Biotechnology Center, um genomische DNA-Bibliotheken vorzubereiten und zu sequenzieren. Die Erwähnung von Handelsnamen oder kommerziellen Produkten in dieser Veröffentlichung dient ausschließlich der Bereitstellung spezifischer Informationen und stellt keine Empfehlung oder Billigung durch das US-Landwirtschaftsministerium dar. USDA ist ein Anbieter und Arbeitgeber für Chancengleichheit.

Milton T. King

Aktuelle Adresse: USDA-ARS Cereal Disease Laboratory, St. Paul, MN, USA

Abteilung für medizinische Mikrobiologie und Immunologie, Abteilung für Bakteriologie, University of Wisconsin, Madison, WI, USA

Milton T. Drott, Sung Chul Park und Nancy P. Keller

Abteilungen für Botanik und Bakteriologie, University of Wisconsin, Madison, WI, USA

Yen-wen Wang, Lynn Harrow und Anne Pringle

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Konzeptualisierung: MTD, AP. Experimentieren: MTD, SCP, YW. Datenanalyse: MTD, SCP. Die Finanzierung erfolgte durch AP, MTD und NPK. MTD hat das Manuskript mit Überarbeitungen von AP und Beiträgen von SCP, YW, LH und NPK verfasst. Alle Autoren haben die endgültige Fassung des Manuskripts gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Milton T. Drott, Nancy P. Keller oder Anne Pringle.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Drott, MT, Park, SC, Wang, Yw. et al. Die Pangenomik des Knollenblätterpilzes Amanita phalloides und von Agaricales zeigt die dynamische Entwicklung von Toxingenen in einem invasiven Bereich. ISME J 17, 1236–1246 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01432-x

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Eingegangen: 10. Dezember 2022

Überarbeitet: 01. Mai 2023

Angenommen: 04. Mai 2023

Veröffentlicht: 23. Mai 2023

Ausgabedatum: August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-023-01432-x

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